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腹腔注射台盼蓝苏木精伊红染色法显示巨噬细胞、肥大细胞、胶原纤维和弹性纤维

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台盼蓝苏木精伊红染色法

方法:

⑴取大白鼠(体重250~300克)或小白鼠(25克)皮下或腹腔注射0.2~0.5%台盼蓝(Trypan blue)水溶液或生理盐水(stroke-physiological saline solution)溶液,注射量:每次注射2~3毫升/公斤体重,每天一次,连续注射3~6天。

⑵杀死动物前3~4小时再注射一次。

⑶断头或颈部放血,取肠系膜和肠管铺在云母片上。

⑷以Helly液或酒精甲醛醋酸液(FAA或AFA)固定30~60分钟。

Helly液:蒸馏水100毫升,加入重铬酸钾(红矾钾,Potassium dichromate

)2.5克,升汞(二氯化汞、氯化汞、氯化高汞,Mercury dichloride)5克,煮沸溶解。用时加40%甲醛(蚁醛、福尔马林,Formaldehyde)水溶液5毫升。又称Zenker-Formol液。固定细胞质较好,特别适于显示某些特殊颗粒如胰岛和脑垂体腺细胞。

FAA液:甲醛(Formaldehyde)10毫升,95%酒精(Alcohol)或无水酒精(Absolute alcohol; Anhydrous alcohol)80~90毫升,冰醋酸(Glacial acetic acid,GAA)5~10毫升

⑸固定后处理:Helly液固定,流水冲洗1小时,70%酒精加少量碘酒(Iodine)脱汞至无色,入5%硫代硫酸钠(次亚硫酸钠、大苏打、海波,Sodium Thiosulfate)水溶液处理,水洗;

AAF或FAA或AFA液固定者,水洗两次。

⑹用1%地衣红液37℃温箱染弹性纤维15~30分钟。

地衣红染液:地衣红(苔红素,Orcein)1克,70~80%酒精100毫升,硝酸(Nitric acid)或盐酸(Hydrochloric acid)1毫升

⑺流水冲洗,蒸馏水洗。

⑻Ehrlich苏木精染细胞核,水洗。

Ehrlich苏木精染液:苏木精(Hematoxylin)2克溶于95%酒精100毫升,加蒸馏水及纯甘油(丙三醇,Glycerine)各100毫升,钾明矾(明矾、白矾、钾矾、钾铝矾,钾铵明矾,Aluminium potassium sulfate,Potassium alum) 3克及冰醋酸10毫升,溶液呈红色。用纱布封闭瓶口,两周后成熟,溶液呈暗红紫色。适于块染(用水或50%酒精稀释4~5倍,染1~2天)。

⑼伊红染细胞质,水洗。

⑽快速经95%酒精两次分色兼脱水,无水酒精脱水两次各2分钟。

⑾用吸水纸吸干铺片。

⑿入石炭酸(苯酚,Carbolic acid

)二甲苯(Dimethylbenzene)脱水,二甲苯透明。

⒀镜检,如结果满意,将肠管剪下,将肠系膜剪成小片或四边形,用玻片插入二甲苯中, 将小片组织用镊子捞在洁净的载玻片上,滴树胶加盖玻片封固,温箱烘干。

结果:

细胞核(Nucleus )呈蓝紫芭或黑色;

细胞质(Cytoplasm)红色;

巨噬细胞(Macrophage)胞质内有蓝色的吞噬颗粒;

成纤维细胞(Fibroblasts)淡灰蓝色,有少量吞噬颗粒;

胶原纤维(Collagenic fiber)红色;

弹性纤维(Elastic fibers)红褐色。


肝脏Kuffer细胞显示法

方法:

⑴选择大小鼠、兔、豚鼠等腹腔注射台盼蓝液若干次。300克动物总量10毫升。大白鼠注射:第一次0.5毫升,以后每天1~1.5毫升,七天后其皮肤 、巩膜、鼻尖处可见较深的蓝色,按常规方法杀死动物。

试剂配制:

台盼蓝0.5克,蒸馏水100毫升,过滤于锥形瓶内。用洁净的棉花塞紧瓶口,在沸水内消毒10~15分钟。

⑵取肝脏组织固定于10%甲醛水溶液。

⑷常规脱水透明、石蜡包埋,切片8微米。

⑸切片贴片(水温45~50℃),烘干(70℃1~2小时或37℃24~72小时)。

⑹切片常规脱蜡,经各级酒精下行入水。

⑺入卡红液核细胞核数分钟,水洗。

卡红液:卡红(Carmine)2克溶于5%铵明矾(铵明矾、铝铵矾、铵矾,Aluminium ammonium sulfate)100毫升,煮沸1小时,加水至100毫升。

⑻常规脱水,透明,封片。

结果:

Kupffer细胞胞质内有大小不等的蓝色颗粒(台盼蓝);细胞核红色。

 腹腔注射台盼蓝苏木精伊红染色法显示巨噬细胞、肥大细胞、胶原纤维和弹性纤维

高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞,具有吞噬作用的功能.当异物入侵机体时,能招引巨噬细胞,巨噬细胞主动将异物移行聚集,将异物吸附在细胞表面,随之吸附区域的细胞膜向内凹陷,伸出伪足包围异物,并吞入胞质,形成吞噬液,继而在细胞之中的初级溶酶体与吞噬泡融合形成吞噬媒体,异物消除.这个实验中的台盼兰染色剂对于小鼠的巨噬细胞相当于异物.台盼蓝可被巨噬细胞吞噬,所以可用于巨噬细胞的活体染色剂

原理:活细胞不会被台盼蓝染成蓝色,而死细胞会被染成淡蓝色.正常的活细胞,胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内;而丧失活性或细胞膜不完整的细.

中英文名称:台盼蓝(Trypan Blue)或称台盼兰、锥虫蓝、曲利苯蓝 分子式:C34H24N6O14S4Na4 分子量: 960.82 可溶于水(10mg/ml) 是细胞活性染料,常用于检测细胞膜的完整性.还常用于检测细胞是否存活.活细胞不会被染成蓝色,而死细胞会被染成淡蓝色.台盼蓝可被巨噬细胞吞噬,故可用于巨噬细胞的活体染色剂.